COMPARTIR | IMPRIMIR | CORREU ELECTRÒNIC
Vull començar amb un recordatori que sovint es perd en les discussions públiques: Les vacunes d'ARNm de la Covid són productes mèdics realment nous.
Abans de les autoritzacions d'emergència del 2020, la tecnologia de les vacunes d'ARNm no s'havia desplegat mai a gran escala en humans. Només dos assajos clínics, un de Pfizer-BioNTech i un de Moderna, havien provat aquesta plataforma en persones. En total, aproximadament 37,000 persones havien rebut una vacuna d'ARNm en la història de la medicina (sense incloure l'experiència anterior amb vacunes contra la ràbia, el CMV i el càncer, limitades a estudis de fase inicial molt més petits). Això no és una crítica; és simplement una constatació de fet. Però sí que significa que el perfil de seguretat a llarg termini d'aquests productes no s'entenia, i continua estant, completament.
El que segueix és familiar per a gairebé tots els biòlegs moleculars. És complicat, però intento simplificar-ho, donat el que hi ha en joc. És important exposar clarament el marc molecular per a tothom, perquè la manera com es fabriquen aquestes vacunes determina directament què hi ha dins del vial.. I el que hi ha dins del vial, un cop injectat, viatjarà per tot el cos i activarà una cascada d'esdeveniments que poden tenir implicacions per a la salut a llarg termini.
La transcripció in vitro no és només un detall de fabricació
Les vacunes d'ARNm modificat es produeixen mitjançant un procés anomenat transcripció in vitro (IVT))La IVT és el mètode utilitzat per sintetitzar l'ARNm modificat que finalment es converteix en l'ingredient actiu de la vacuna.
Això no és un tecnicisme trivial. La IVT dóna forma fonamentalment a la composició molecular del producte final.
Científics de BioNTech, inclosos els que han participat directament en el desenvolupament de la vacuna de Pfizer, han publicat una revisió detallada1 que descriu com les reaccions IVT generen no només l'ARNm complet previst, sinó també una sèrie de subproductes i impureses, com s'eliminen normalment i quines poden ser les seves conseqüències biològiques si persisteixen. Aquestes instruccions de fabricació juntament amb els subproductes que creen també van ser descrites detalladament per Moderna a les seves patents (US10,653,712 B2 i US10,077,439 B2). Però el que és més important, aquesta biologia molecular estava ben establerta molt abans de la Covid. Res d'això és especulatiu.
El material de partida: plantilles d'ADN
En essència, una reacció IVT comença amb ADN bicatenari que codifica la proteïna desitjada. En aquest cas, la proteïna espicular del SARS-CoV-2.
La seqüència codificadora de l'espiga utilitzada en les vacunes d'ARNm és genèticament modificada per millorar l'estabilitat i la tolerància cel·lular, incloent-hi dues substitucions d'aminoàcids que la distingeixen del pic viral. Aquesta modificació és intencional.
La plantilla d'ADN en si mateixa pot adoptar diferents formes. Durant els primers assajos clínics de Pfizer, es van utilitzar fragments d'ADN generats per PCR. Tanmateix, el procés de fabricació comercial es basava en ADN derivat de plasmidis. Això és important perquè els plasmidis contenen seqüències reguladores addicionals. En el cas de Pfizer, aquestes inclouen elements com el promotor de SV40 i les seqüències ori, que plantegen preocupació si entressin a les cèl·lules humanes.
Un cop s'afegeix aquesta plantilla d'ADN a la reacció IVT, juntament amb l'ARN polimerasa i altres components, es transcriu a ARNm (Figura 1).
IVT produeix subproductes per disseny
Tot i que el resultat desitjat de l'IVT és el producte d'ARNm de longitud completa previst, el resultat real és més complex. Aquests inclouen diversos subproductes en forma de (1) diverses espècies d'ARN, inclòs l'ARN bicatenari (dsRNA), (2) ADN unit a l'ARN (híbrids ARN-ADN) i (3) l'ADN lliure de la plantilla original (Figura 2).
La formació d'aquests subproductes està ben documentada i és inevitable, i és per això que la purificació posterior és absolutament essencial per a la seguretat.
Figura 2. Subproductes i contaminants de la fabricació de TVI. Imatge adaptada de 1.
La purificació té limitacions conegudes
Després de la fabricació, hi ha dos passos de purificació necessaris per eliminar primer l'ADN i després els subproductes d'ARN (Figura 3):
Figura 3. Eliminació de subproductes de la TVI. Imatge adaptada de 2.
Per eliminar l'ADN, s'afegeix un enzim a la mescla de reacció anomenat DNasa I, que s'utilitza habitualment per degradar l'ADN contaminant. Tot i que la DNasa I és eficaç contra l'ADN motlle lliure, múltiples estudis, inclòs el treball dels mateixos científics de BioNTech, mostren que la DNasa I és ineficient a l'hora d'eliminar l'ADN unit a l'ARN (híbrids ARN-ADN).
Aquesta limitació no és controvertida. Està documentada a la literatura.
Què han demostrat les anàlisis independents
Aquest context és crucial per interpretar anàlisis independents recents de vials de vacunes acabades.
Investigadors3 i reguladors4 han informat que han detectat contaminants d'ADN en pràcticament tots els vials analitzats. Aquests contaminants incloïen tant ADN bicatenari com híbrids d'ARN-ADN que semblaven resistents a la digestió amb DNasa I.
En algunes mostres, l'ADN que codifica l'espiga estava present a nivells més de 100 vegades superiors a altres seqüències plasmídiques.5, cosa que suggereix una digestió desigual o incompleta. La seqüenciació i les anàlisis de PCR quantitatives van detectar fragments d'ADN amb una longitud mitjana d'uns 200 parells de bases, alguns dels quals superaven les 4 quilobases. En diversos casos, es van observar seqüències que abastaven gairebé tot el plasmidi.
En conjunt, aquestes troballes plantegen seriosos dubtes sobre la consistència i la integritat de la purificació durant la fabricació a gran escala, i sobre les possibles conseqüències biològiques dels àcids nucleics residuals en les persones.
Per què els contaminants d'àcids nucleics són importants biològicament
L'ARN i l'ADN són potents activadors de les vies immunitàries innates. Això no és especulatiu. Els receptors de reconeixement de patrons i la via cGAS-STING responen robustament als àcids nucleics estranys, desencadenant inflamació, inhibició del creixement i fins i tot mort cel·lular.
Aquests mecanismes són precisament el motiu pel qual els productes de teràpia gènica estan subjectes a una estricta supervisió de seguretat.
Irònicament, les vacunes d'ARNm contra la Covid van ser dissenyades amb modificacions específiques per reduir aquesta potent activació immunitària innata. Però els híbrids d'ARN-ADN i els fragments d'ADN encara provocaran fortes respostes immunitàries malgrat aquestes modificacions.
La persistència planteja noves preguntes
Ara hi ha proves substancials que demostren que l'ARNm i la proteïna de l'espícula persisteixen en els teixits humans durant setmanes, mesos i fins i tot anys després de la vacunació (Taula 1).
Encara no sabem si aquesta persistència reflecteix una estabilitat prolongada de l'ARNm, una traducció contínua o mecanismes basats en l'ADN. Però, atesa la plausibilitat de la integració de l'ADN i l'ADN plasmídic no integrat de llarga vida a les cèl·lules musculars,6 No és irraonable suposar que la persistència de l'ARNm, la proteïna i els anticossos de Spike contra Spike anys després de la vacunació no està relacionada amb les impureses i els subproductes de l'ADN després de la IVT.
Taula 1. Persistència de l'ARNm i de la proteïna de l'espiga després de la vacunació en humans
Implicacions de seguretat a curt i llarg termini
En conjunt, aquestes dades plantegen diverses consideracions importants de seguretat.
En primer lloc, s'han reportat reaccions immunitàries agudes, incloent-hi tempestes de citocines i anafilaxi, immediatament després de la vacunació. Aquestes respostes inflamatòries fortes no s'han de descartar directament com a no relacionades amb impureses, sobretot tenint en compte el que se sap sobre l'activació immunitària induïda per àcids nucleics.
En segon lloc, i més important, hi ha els riscos a llarg termini. L'expressió persistent de les espigues podria contribuir plausiblement a les síndromes immunitàries cròniques. Encara més preocupant és la possibilitat d'integració de l'ADN, que comporta riscos de mutagènesi insercional o disrupció gènica. Això significa un risc de càncer o defectes del desenvolupament depenent d'on i a quina edat es va integrar l'ADN.
Cal destacar que la mateixa FDA afirma a les seves fitxes informatives que aquestes vacunes no han s'ha avaluat la carcinogenicitat (formació de càncer) o la genotoxicitat (dany a l'ADN), un punt que seria rutinari i esperat en la supervisió de la teràpia gènica, on el seguiment a llarg termini és estàndard.
La bretxa reguladora al voltant de l'ADN en les vacunes d'ARNm
Com que ja no hi ha cap controvèrsia sobre l'existència d'ADN residual a les vacunes d'ARNm, la qüestió és si les directrius i els límits de seguretat actuals són adequats per a les vacunes d'ARNm. Ens han assegurat que els subproductes d'ADN estan dins dels límits establerts a les directrius reglamentàries. Aleshores, quina és la guia de la FDA sobre els subproductes i contaminants de l'ADN?
La guia de la FDA més citada sobre l'ADN residual (≤10 ng per dosi) es va desenvolupar per a vacunes virals produïdes en cèl·lules vives fragmentades i "nues", amb una capacitat limitada per entrar a les cèl·lules humanes. Tanmateix, les vacunes d'ARNm no es produeixen en cèl·lules, el seu ADN residual no deriva de la cèl·lula hoste i, el més important, l'ADN de les vacunes d'ARNm no està nu. Està associat amb sistemes d'administració de LNP, que específicament faciliten molt l'entrada de l'ADN a l'interior de les cèl·lules. La guia de la FDA del 2010 és clara que no estableix un llindar de seguretat rellevant per a l'ADN associat amb productes basats en LNP.
L'altra guia que es cita habitualment és la de l'OMS per a teràpies de proteïnes recombinants que aborden l'ADN residual en productes com ara anticossos monoclonals o hormones produïdes en cèl·lules modificades. Un cop més, l'ADN residual s'origina a partir de cèl·lules hostes o plasmidis d'expressió, es presenta com a traça d'ADN no encapsulat (nu), i el producte final és una proteïna purificada, no una teràpia basada en àcids nucleics (vacuna d'ARNm). Per tant, aquesta guia no s'aplica a les vacunes d'ARNm.
Ni les normes reguladores de la FDA ni les de l'OMS, que es citen més sovint per a l'ADN residual, van ser desenvolupats per a vacunes d'ARNm i no aborden directament aquest problema de seguretat.
Què va dir l'OMS sobre les vacunes d'ARNm — Després del desplegament
El 2022, l'Organització Mundial de la Salut va publicar una guia específica sobre les vacunes d'ARNm.7Cal destacar que aquest document es va publicar després el desplegament global d'aquests productes. Indica específicament que aquesta guia va ser en resposta a: “els problemes de seguretat, producció i regulació associats a aquesta nova tecnologia.El document també fa diverses afirmacions importants:
"Com que encara no hi ha informació detallada disponible sobre els mètodes utilitzats per a la producció, els controls encara no estan estandarditzats per a vacunes d'ARNm segures i eficaces, i certs detalls continuen sent de propietat i, per tant, no estan disponibles públicament, no és factible desenvolupar directrius o recomanacions internacionals específiques en aquest moment."
A més, afirma: “Els procediments detallats de producció i control... s'haurien de discutir i aprovar amb l'ARN [Autoritat Reguladora Nacional].] cas per cas individual."
L'OMS reconeix que els controls de les vacunes d'ARNm encara no estaven estandarditzats i que no era factible establir directrius o recomanacions internacionals específiques. A més, cal una supervisió reguladora per a l'avaluació cas per cas per part de les autoritats nacionals.
Això es va dir després que es despleguessin les vacunes d'ARNm.
I en el moment de la redacció d'aquest Substack, la FDA encara no ha establert directrius estandarditzades per a les vacunes d'ARNm ni ha proporcionat cap evidència ni dades basades en la seguretat per donar suport a qualsevol límit d'ADN en les vacunes d'ARNm.
Finalment, val la pena repetir-ho: si bé la tecnologia de l'ARNm no és nova, abans de la Covid es regulava com a teràpia gènica, no com a vacuna tradicional. Els problemes de seguretat relacionats amb els subproductes de l'ADN de les vacunes contra la Covid seran els mateixos amb qualsevol vacuna d'ARNm, incloses les de la grip, el VRS o fins i tot les de les vacunes d'ARNm contra el càncer.
Això és degut a que els productes d'ARNm són fonamentalment diferents. Han d'entrar a les cèl·lules i instruir-les perquè produeixin una proteïna estranya. Això és diferent de qualsevol altra vacuna convencional que administri la proteïna directament. No hi ha cap precedent clínic per a aquesta plataforma, i no hi ha cap precedent clínic per a la dosificació repetida. I certament cap precedent a escala poblacional.
En aquesta etapa, sense pandèmia, amb l'acumulació de dades mecanístiques i observacions clíniques, i la proliferació de vacunes d'ARNm al mercat, necessitem transparència i una participació directa amb estudis de seguretat seriosos per part dels reguladors, en particular la FDA que estableix directrius crítiques per a la fabricació d'aquests productes, especialment pel que fa als subproductes de l'ADN.
La nova tecnologia exigeix un escrutini innovador, no silenci, manipulació ni censura.
referències
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S, et al. Mol Pharm. 4 d'abril de 2022;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang et al. (2004) – “Detecció de la integració de l'ADN plasmídic a l'ADN genòmic de l'hoste després de la injecció intramuscular i l'electroporació” (Gene Therapy, 2004). En ratolins, es va injectar ADN plasmídic nu per via intramuscular, seguit d'electroporació per millorar l'absorció. Mitjançant una PCR altament sensible en ADN genòmic purificat (amb separació en gel per eliminar formes extracromosòmiques), els autors van identificar quatre esdeveniments d'integració independents 4 setmanes després de la injecció. La seqüenciació d'unions va confirmar els llocs d'integració aleatoris (sense punts calents preferencials), d'acord amb la unió d'extrems no homòloga. La freqüència d'integració va ser baixa però mesurable. Aquesta és una de les demostracions més clares d'esdeveniments d'integració espontània reals in vivo per a l'ADN plasmídic nu al múscul. Cal destacar que aquest estudi va utilitzar l'administració millorada d'ADN mitjançant electroporació, que es podria comparar amb l'administració millorada mitjançant LNP.
Martin et al. (1999) – “Vacuna contra la malària amb ADN plasmídic: el potencial per a la integració genòmica després de la injecció intramuscular” (teràpia gènica humana). Aquest estudi anterior va provar l'ADN plasmídic IM en ratolins i va utilitzar la hibridació de Southern blot i la PCR en ADN genòmic d'alt pes molecular per sondar la integració. Tot i que la persistència era majoritàriament extracromosòmica, van informar d'evidències que suggereixen una integració rara en algunes mostres (tot i que no seqüenciada tan definitivament com treballs posteriors). Va establir un punt de referència per a un risc baix, però va reconèixer el potencial d'esdeveniments de molt baixa freqüència, influint en les directrius posteriors de la FDA sobre les vacunes d'ADN.
Ledwith et al. (2000) – “Vacunes d'ADN plasmídic: Investigació de la integració en l'ADN cel·lular de l'hoste després de la injecció intramuscular en ratolins” (Intervirology). L'ADN plasmídic nu injectat IM en ratolins va mostrar, i tot i que no es va observar cap integració detectable, encara es va detectar ADN al múscul quàdriceps fins a les 26 setmanes. L'ADN era extracromosòmic.
7 Comitè d'Experts de l'OMS en Estandarització Biològica, 74è informe, Annex 3. Avaluació de la qualitat, seguretat i eficàcia de les vacunes d'ARN missatger per a la prevenció de malalties infeccioses: consideracions reglamentàries https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
-
La Dra. Charlotte Kuperwasser és una professora distingida del Departament de Biologia del Desenvolupament, Molecular i Química de la Facultat de Medicina de la Universitat Tufts i la directora del Laboratori de Convergència de Tufts a Tufts. La Dra. Kuperwasser és reconeguda internacionalment per la seva experiència en biologia de les glàndules mamàries i càncer de mama, així com per la seva prevenció. És membre del Comitè Assessor sobre Pràctiques d'Immunització.
Veure totes les publicacions
